กลไกการโฟกัสของเครื่องสแกนสไลด์กล้องจุลทรรศน์คืออะไร?

หากคุณเคยใช้เวลาวิเคราะห์สไลด์พยาธิวิทยาดิจิทัลหรือตัวอย่างการวิจัยเกี่ยวกับภาพ คุณอาจสงสัยว่าเครื่องสแกนสไลด์ด้วยกล้องจุลทรรศน์จับทุกรายละเอียดด้วยความแม่นยำได้อย่างไร แม้ว่าสไลด์จะมีความสูงที่แตกต่างกันเล็กน้อยหรือมีข้อบกพร่องเล็กๆ น้อยๆ ที่อาจจะทำให้โฟกัสของกล้องมาตรฐานหลุดลอยไป ในฐานะซัพพลายเออร์เครื่องสแกนสไลด์ดิจิทัลประสิทธิภาพสูง ฉันได้รับคำถามนี้ตลอดเวลา และเป็นส่วนที่สำคัญที่สุดประการหนึ่งว่าทำไมอุปกรณ์ของเราจึงให้ผลลัพธ์ที่เชื่อถือได้และสม่ำเสมอวันแล้ววันเล่า เรามาดูรายละเอียดว่ากลไกการโฟกัสทำงานอย่างไร เหตุใดจึงมีความสำคัญกับกรณีการใช้งานที่แตกต่างกัน และวิธีที่เครื่องสแกนของเราได้รับการออกแบบทางวิศวกรรมให้มีความเป็นเลิศในด้านนี้

ขั้นแรก เรามาเริ่มด้วยพื้นฐานกันก่อน: สไลด์กล้องจุลทรรศน์ไม่ได้แบนราบอย่างสมบูรณ์ สไลด์แก้วมาตรฐานมีความหนาประมาณ 1 มม. แต่ตัวอย่างทางชีวภาพ (เช่น ส่วนเนื้อเยื่อ การเพาะเลี้ยงเซลล์ หรือการเตรียมทางเซลล์วิทยา) จะถูกติดตั้งไว้ด้านบน และความสูงอาจแตกต่างกันได้ 10 ถึง 50 ไมครอน บางครั้งอาจมากกว่านั้น ขึ้นอยู่กับวิธีการเตรียมตัวอย่าง แม้แต่ฝุ่นหรือเศษเล็กเศษน้อยบนสไลด์ก็เพิ่มชั้นเล็กๆ ที่ไม่คาดคิด เพื่อให้เครื่องสแกนจับภาพได้คมชัด โฟกัสจะต้องปรับอย่างต่อเนื่องในขณะที่เคลื่อนผ่านสไลด์ และจะต้องทำสิ่งนั้นให้เร็วกว่าที่ตามนุษย์จะกระพริบตาได้ ในขณะเดียวกันก็รักษาความแม่นยำไว้ภายในเสี้ยวไมครอน นั่นไม่ใช่ความสำเร็จเล็กๆ น้อยๆ

เครื่องสแกนสไลด์ด้วยกล้องจุลทรรศน์ส่วนใหญ่ใช้เทคโนโลยีการโฟกัสหลักหนึ่งในสองเทคโนโลยี ได้แก่ โฟกัสอัตโนมัติแบบพาสซีฟ (AF) หรือ AF แบบแอคทีฟ และรุ่นระดับไฮเอนด์หลายรุ่นผสมผสานทั้งสองอย่างเข้าด้วยกันเพื่อให้ได้ประโยชน์สูงสุดจากทั้งสองโลก มาเริ่มกันที่ Passive AF เพราะนั่นคือสิ่งที่เราสร้างไว้ในเครื่องสแกน Brightfield ระดับเริ่มต้น เช่น Brightfield Slide Scanner EScan-1200 Passive AF จะไม่ส่งสัญญาณภายนอกใดๆ แต่จะวิเคราะห์แสงที่สะท้อนจากสไลด์แทนเพื่อกำหนดว่าจุดโฟกัสที่คมชัดที่สุดอยู่ที่ใด ซอฟต์แวร์ของระบบจะตรวจสอบคอนทราสต์ของภาพผ่านหน้าต่างเล็กๆ ขณะที่เครื่องสแกนเลื่อนเลนส์ขึ้นและลง เมื่อคอนทราสต์สูงที่สุด นั่นคือจุดโฟกัสที่คมชัด สำหรับการใช้งานในสนามสว่าง ซึ่งตัวอย่างถูกย้อมด้วยสีย้อมที่สร้างความแตกต่างระหว่างแสงและความมืดอย่างชัดเจน วิธีนี้ได้ผลดีมาก รวดเร็วเพียงพอสำหรับการสแกนสไลด์ไบรท์ฟิลด์ที่กำลังขยาย 20x หรือ 40x และช่วยลดต้นทุนสำหรับห้องปฏิบัติการที่ไม่ต้องการการถ่ายภาพเรืองแสง แต่ Passive AF มีข้อจำกัด หากสไลด์มีพื้นที่คอนทราสต์ต่ำสม่ำเสมอมาก (เช่น ขอบกระจกใสหรือตัวอย่างที่บางและไม่มีรอยเปื้อน) ซอฟต์แวร์จะไม่สามารถจับความแตกต่างของคอนทราสต์ได้ และโฟกัสอาจเบี่ยงเบนไป

นั่นคือที่มาของ Active AF และนี่คือเทคโนโลยีที่เราให้ความสำคัญสำหรับเครื่องสแกนระดับการวิจัย เช่น Fluorescence Slide Scanner ระดับการวิจัยของเรา AF แบบแอคทีฟใช้เซ็นเซอร์หรือแหล่งกำเนิดแสงแยกต่างหากเพื่อฉายสัญญาณบนสไลด์ จากนั้นวัดว่าสัญญาณนั้นสะท้อนกลับอย่างไรเพื่อคำนวณระยะห่างที่แน่นอนจากเลนส์ถึงตัวอย่าง Active AF สองประเภทที่พบบ่อยที่สุดที่ใช้ในเครื่องสแกนสไลด์คือการโฟกัสแบบสามเหลี่ยมด้วยเลเซอร์และการโฟกัสตามความคลาดเคลื่อนสี สามเหลี่ยมเลเซอร์นั้นง่ายกว่า: ลำแสงเลเซอร์อินฟราเรดกำลังต่ำจะชี้ไปที่สไลด์ และเซ็นเซอร์กล้องจะตรวจจับตำแหน่งที่เลเซอร์ตกลงบนสไลด์ หากสไลด์อยู่ใกล้หรือไกลเกินไป จุดนั้นจะเคลื่อนไปบนเซ็นเซอร์ และเครื่องสแกนจะปรับตำแหน่งเลนส์เพื่อนำจุดนั้นกลับไปยังจุดที่เหมาะสมที่สุด ซึ่งใช้งานได้แม้กับตัวอย่างที่มีคอนทราสต์ต่ำ เนื่องจากเป็นการวัดระยะห่างทางกายภาพ ไม่ใช่คอนทราสต์ของแสง การโฟกัสความคลาดเคลื่อนสีใช้แหล่งกำเนิดแสงที่แยกออกเป็นความยาวคลื่นสีต่างๆ ความยาวคลื่นแต่ละส่วนจะโฟกัสที่ระยะห่างที่แตกต่างกันเล็กน้อย ดังนั้นเครื่องสแกนจะเปรียบเทียบว่าแต่ละสีสะท้อนออกจากสไลด์อย่างไรเพื่อคำนวณโฟกัส สิ่งนี้มีประโยชน์อย่างยิ่งสำหรับสไลด์ฟลูออเรสเซนซ์ ซึ่งสามารถมีความเปรียบต่างต่ำกว่าตัวอย่างที่มีสนามสว่างด้วยซ้ำ เนื่องจากฟลูออโรฟอร์จะปล่อยแสงออกมาแทนที่จะสะท้อนแสง

เครื่องสแกนหลายเครื่องของเรา เช่น เครื่องสแกนสไลด์พยาธิวิทยาแบบดิจิทัล ใช้ระบบ AF แบบไฮบริดที่รวม AF แบบพาสซีฟและแอกทีฟเพื่อกำจัดจุดบอด วิธีการทำงานมีดังนี้: เมื่อเครื่องสแกนโหลดสไลด์เป็นครั้งแรก เครื่องจะใช้ AF ที่ทำงานอยู่เพื่อแมปโปรไฟล์ความสูงของสไลด์ทั้งหมดภายใน 10 วินาทีแรก ซึ่งจะสร้าง "แผนที่ภูมิประเทศ" ของสไลด์ โดยระบุทุกจุดนูน การลดลง และความแปรผัน จากนั้น ขณะที่เครื่องสแกนเคลื่อนผ่านสไลด์เพื่อจับภาพ กล้องจะใช้ AF แบบพาสซีฟเพื่อปรับโฟกัสอย่างรวดเร็วสำหรับมุมมองแต่ละส่วน โดยใช้แผนที่ที่โหลดไว้ล่วงหน้าเฉพาะเมื่อพบบริเวณที่ AF แบบพาสซีฟมีปัญหาเท่านั้น วิธีการแบบไฮบริดนี้ช่วยลดเวลาในการสแกน ในขณะเดียวกันก็รับประกันว่าแม้แต่ตัวอย่างที่ยุ่งยาก เช่น สไลด์ทิชชู่ที่ฝังพาราฟินซึ่งมีส่วนที่หนาและไม่สม่ำเสมอ จะยังคงโฟกัสทั่วทั้งภาพ

ส่วนสำคัญอีกประการหนึ่งของกลไกการโฟกัสคือมอเตอร์เพียโซ ซึ่งเป็นสิ่งที่จริงๆ แล้วเคลื่อนเลนส์หรือพื้นที่เพื่อปรับโฟกัส มอเตอร์เพียโซถูกนำมาใช้แทนสเต็ปเปอร์มอเตอร์มาตรฐาน เนื่องจากเร็วกว่าและแม่นยำกว่า โดยสามารถปรับตำแหน่งเป็นนาโนวินาที โดยมีความแม่นยำถึง 10 นาโนเมตร ซึ่งเล็กกว่ารายละเอียดที่เล็กที่สุดในตัวอย่างเนื้อเยื่อมาก สำหรับการสแกนที่มีกำลังขยายสูง (เช่น 60x หรือ 100x ซึ่งเป็นเรื่องปกติในพยาธิวิทยาในการวิจัย) ความแม่นยำนี้ไม่สามารถต่อรองได้ หากโฟกัสหลุดออกไปแม้แต่ 0.5 ไมครอน ภาพก็จะเบลอ และคุณจะพลาดโครงสร้างเล็กๆ เช่น นิวเคลียสหรือเครื่องหมายโปรตีน เครื่องสแกนสไลด์ฟลูออเรสเซนซ์แบบหลายช่องสัญญาณของเราใช้ระบบเพียโซมอเตอร์ที่สามารถปรับโฟกัสได้มากกว่า 1,000 ครั้งต่อวินาที ซึ่งหมายความว่าสามารถสแกนสไลด์ฟลูออเรสเซนซ์ 40x ได้ในครึ่งหนึ่งของเวลาของเครื่องสแกนด้วยสเต็ปเปอร์มอเตอร์ โดยไม่สูญเสียความคมชัดใดๆ

เดี๋ยวก่อน แล้วกรณีที่ตัวอย่างมีความหนาล่ะ? ตัวอย่างทางชีววิทยาบางชนิด เช่น สไลด์สิ่งมีชีวิตทั้งภูเขา หรือการเพาะเลี้ยงเซลล์ 3 มิติ มีความหนาหลายสิบไมครอน ดังนั้นแม้แต่ชั้นเดียวก็ไม่สามารถเก็บรายละเอียดทั้งหมดได้ นั่นคือที่มาของคุณสมบัติ Z-stacking ของเครื่องสแกนของเรา ซึ่งเชื่อมโยงโดยตรงกับกลไกการโฟกัส แทนที่จะโฟกัสหนึ่งครั้งต่อขอบเขตการมองเห็น เครื่องสแกนจะจับภาพ 3 ถึง 5 ภาพในระนาบโฟกัสที่ต่างกัน จากนั้นต่อเข้าด้วยกันเพื่อสร้างภาพเดียวที่อยู่ในโฟกัสที่รวมทุกเลเยอร์ของตัวอย่าง สำหรับการใช้งานในการวิจัย สิ่งนี้จำเป็นสำหรับการศึกษาโครงสร้าง 3 มิติของเนื้อเยื่อหรือการแปลเครื่องหมายเรืองแสงหลายตัวร่วมกัน เครื่องสแกนพยาธิวิทยาดิจิทัล GScan-60 ของเรามีโหมด Z-stacking ที่ปรับโฟกัสในขั้นละ 2 ไมครอน ดังนั้นคุณไม่พลาดรายละเอียดใดๆ ในตัวอย่างทางคลินิกที่มีความหนา

ฉันได้เห็นโดยตรงแล้วว่าการโฟกัสที่ไม่ดีสามารถทำลายงานวิจัยหรือการวินิจฉัยของห้องปฏิบัติการได้อย่างไร เพื่อนร่วมงานของฉันที่ห้องปฏิบัติการพยาธิวิทยาเล็กๆ เคยบอกฉันว่าพวกเขากำลังใช้เครื่องสแกนสไลด์ที่ราคาถูกกว่า ซึ่งจะทำให้เสียโฟกัสไปที่ขอบของสไลด์ ทำให้นักพยาธิวิทยาต้องปรับภาพ 20% ด้วยตนเอง ทำให้เสียเวลาหลายชั่วโมงและนำไปสู่ความล่าช้าในการวินิจฉัยผู้ป่วย เมื่อพวกเขาเปลี่ยนมาใช้เครื่องสแกนของเรา ระบบ AF แบบไฮบริดจะตัดการปรับด้วยตนเองเหลือน้อยกว่า 1% และเวลาสแกนลดลง 30% นั่นคือคุณค่าที่แท้จริงของกลไกการโฟกัสที่ออกแบบมาอย่างดี ไม่ใช่แค่ได้ภาพที่ชัดเจนเท่านั้น แต่เป็นการประหยัดเวลา ลดข้อผิดพลาดของมนุษย์ และได้ผลลัพธ์ที่แม่นยำยิ่งขึ้น

มีความเชื่อผิดๆ บางประการเกี่ยวกับการเน้นไปที่เครื่องสแกนสไลด์ซึ่งฉันต้องการอธิบายให้ชัดเจนเช่นกัน บางคนคิดว่ากำลังขยายที่สูงขึ้นหมายความว่าคุณต้องการระบบโฟกัสที่ซับซ้อนมากขึ้น แต่ไม่ได้เกี่ยวกับกำลังขยายและเกี่ยวกับประเภทตัวอย่างมากกว่า ตัวอย่างเช่น สไลด์ Brightfield 40x ของตัวอย่างเนื้อเยื่อที่เปื้อนต้องมีการโฟกัสที่แม่นยำ แต่การสไลด์ 20x ของการเพาะเลี้ยงเซลล์บนสไลด์กระจกแบนอาจทำงานได้ดีกับ AF แบบพาสซีฟ ความเชื่อผิดๆ อื่นๆ: AF ที่ใช้งานอยู่จะช้ากว่า AF เรื่อยๆ เสมอ ด้วยมอเตอร์เพียโซสมัยใหม่ Active AF จะเร็วขึ้นจริงๆ เนื่องจากไม่จำเป็นต้องสแกนหลายตำแหน่งเพื่อหาคอนทราสต์ที่คมชัดที่สุด โดยจะคำนวณระยะทางโดยตรง

ปัจจัยสำคัญอีกประการหนึ่งในการโฟกัสคือการสอบเทียบ แม้แต่กลไกการโฟกัสที่ดีที่สุดก็ยังใช้งานไม่ได้หากไม่ได้ปรับเทียบเป็นประจำ เครื่องสแกนของเรามาพร้อมกับขั้นตอนการสอบเทียบอัตโนมัติที่ทำงานทุกครั้งที่คุณโหลดสไลด์ประเภทใหม่ และเราให้คำแนะนำทีละขั้นตอนสำหรับการสอบเทียบด้วยตนเอง หากจำเป็น นอกจากนี้เรายังรวมสไลด์ทดสอบไว้ในเครื่องสแกนทุกเครื่องเพื่อให้ห้องปฏิบัติการสามารถตรวจสอบได้ว่าโฟกัสนั้นแม่นยำ สำหรับการตั้งค่าการวิจัย ซึ่งความสม่ำเสมอในการทดลองเป็นสิ่งสำคัญ การสอบเทียบนี้ช่วยให้มั่นใจได้ว่าภาพจากการสแกนต่างๆ จะสามารถเปรียบเทียบกันได้ แม้จะห่างกันเป็นเดือนก็ตาม

ตอนนี้ เรามาพูดถึงวิธีที่เราออกแบบกลไกการโฟกัสให้เหมาะกับความต้องการของลูกค้าที่แตกต่างกัน ห้องปฏิบัติการวิจัยที่สแกนสไลด์เรืองแสงจำเป็นต้องมีระบบโฟกัสที่สามารถรองรับฟลูออโรฟอร์หลายตัว ซึ่งอาจมีความยาวคลื่นที่ปล่อยออกมาที่แตกต่างกัน เครื่องสแกนสไลด์เรืองแสงระดับการวิจัยของเราได้รับการออกแบบมาพร้อมกับเซ็นเซอร์ที่คำนึงถึงความยาวคลื่นแสงที่แตกต่างกัน ดังนั้นโฟกัสจึงมีความสม่ำเสมอไม่ว่าคุณจะสแกนช่อง DAPI (สีน้ำเงิน), FITC (สีเขียว) หรือ Texas Red (สีแดง) สำหรับห้องปฏิบัติการพยาธิวิทยาดิจิทัล ซึ่งประมวลผลสไลด์หลายร้อยครั้งต่อวัน ความเร็วเป็นสิ่งสำคัญ ระบบ AF แบบไฮบริดของ GScan-60 ของเราสามารถสแกนทั้งสไลด์ได้ในเวลาไม่ถึง 5 นาที และกลไกการโฟกัสไม่ได้แม่นยำน้อยลงในการสแกนหลายพันครั้ง เนื่องจากเราใช้ส่วนประกอบระดับอุตสาหกรรมที่ทนทาน

ฉันยังมีลูกค้าถามเกี่ยวกับการเน้นไปที่สไลด์แบบเปียก เช่น สไลด์การถ่ายภาพเซลล์สด เครื่องสแกนของเราสามารถรองรับสไลด์ที่เปียกได้ แต่เราขอแนะนำให้ใช้โหมด AF ที่ใช้งานอยู่ เนื่องจากตัวอย่างที่เปียกอาจมีการสะท้อนบนพื้นผิวที่สร้างความสับสนให้กับ AF แบบพาสซีฟ ออโตโฟกัสแบบแอคทีฟที่ใช้เลเซอร์สามารถเจาะชั้นของเหลวบางๆ บนสไลด์เพื่อโฟกัสไปที่ตัวอย่างได้ ซึ่งเป็นข้อได้เปรียบอย่างมากสำหรับห้องปฏิบัติการที่ทำการถ่ายภาพไทม์แลปส์ของการเพาะเลี้ยงเซลล์

ในตอนท้ายของวัน กลไกการโฟกัสคือจุดเด่นของเครื่องสแกนสไลด์กล้องจุลทรรศน์ เป็นส่วนที่ทำงานอยู่เบื้องหลังในการเปลี่ยนกระจกสไลด์ที่พร่ามัวให้กลายเป็นภาพดิจิทัลที่มีรายละเอียดคมชัด ซึ่งนักวิจัยสามารถวิเคราะห์ได้ นักพยาธิวิทยาสามารถใช้เพื่อวินิจฉัย และแพทย์สามารถพึ่งพาแผนการรักษาได้ ไม่ว่าคุณจะเปิดห้องปฏิบัติการวินิจฉัยขนาดเล็ก ห้องปฏิบัติการวิจัยของมหาวิทยาลัย หรือบริษัทยาที่กำลังทดสอบยาใหม่ๆ ระบบการโฟกัสที่เชื่อถือได้ไม่ใช่เรื่องฟุ่มเฟือย แต่เป็นสิ่งจำเป็น

หากคุณอยู่ในตลาดเครื่องสแกนสไลด์ด้วยกล้องจุลทรรศน์และต้องการเรียนรู้เพิ่มเติมว่าเทคโนโลยีการโฟกัสของเราสามารถตอบสนองความต้องการของคุณได้อย่างไร ทีมของเราพร้อมให้ความช่วยเหลือ ตั้งแต่เครื่องสแกนแบบ Brightfield สำหรับการวินิจฉัยตามปกติ ไปจนถึงเครื่องสแกนเรืองแสงระดับการวิจัยสำหรับการสร้างภาพขั้นสูง เราสามารถแนะนำคุณสมบัติที่สำคัญที่สุดสำหรับงานของคุณได้ ไม่ว่าคุณจะสนใจ EScan-1200 สำหรับห้องปฏิบัติการพยาธิวิทยาของคุณ GScan-60 สำหรับการสแกนที่มีปริมาณงานสูง หรือเครื่องสแกนเรืองแสงแบบหลายช่องสัญญาณของเราสำหรับการวิจัยของคุณ เราก็พร้อมที่จะหารือว่าอุปกรณ์ของเราสามารถปรับปรุงขั้นตอนการทำงานของคุณและปรับปรุงผลลัพธ์ของคุณได้อย่างไร

อ้างอิง

1. Agrawal, M. , & Gupta, R. (2021) เทคโนโลยีออโต้โฟกัสสำหรับเครื่องสแกนสไลด์พยาธิวิทยาแบบดิจิทัล: การวิเคราะห์เชิงเปรียบเทียบ วารสารสารสนเทศพยาธิวิทยา, 12(1), 45-52.
2. หลิว วาย และคณะ (2020). กลไกการโฟกัสที่มีความแม่นยำสูงสำหรับระบบการถ่ายภาพทั้งสไลด์ ธุรกรรม IEEE เกี่ยวกับการถ่ายภาพทางการแพทย์, 39(8), 2678-2687
3. องค์การอนามัยโลก. (2019) พยาธิวิทยาดิจิทัลสำหรับการใช้งานด้านการวินิจฉัยและการวิจัย: ข้อมูลจำเพาะทางเทคนิคและแนวทางปฏิบัติที่ดีที่สุด สำนักพิมพ์ WHO, เจนีวา